細胞水平染料木素協同維生素D3的抗骨質疏松作用（二）

2 結果與分析

2.1 維生素D₃聯合染料木素對MG-63細胞增殖和分化的細胞協同影響

采用MTT法測定藥物作用細胞24h后MG-63的細胞存活率。如圖1a所示，水平素D疏松維生素D₃在1.56～100.00μmol/L濃度對MG-63細胞無毒性，染料在6.25，木素12.50，維生25.00，骨質50.00，作用100.00μmol/L濃度可明顯促進MG-63細胞的細胞協同增殖（P＜0.05）。如圖1b所示，水平素D疏松染料木素在1.56～50.00μmol/L濃度對MG-63細胞無毒性。染料染料木素濃度在3.12，木素6.25和12.50μmol/L可顯著促進MG-63細胞的維生增殖（P＜0.05）。故選擇1.56，骨質3.12，作用6.25，細胞協同12.50，25.00，50.00μmol/L濃度進行組合。如圖1c所示，低濃度的維生素D₃和染料木素聯合用藥對MG-63細胞的增殖具有協同作用，且濃度在6.25μmol/L時更為顯著。

ALP作為成骨細胞分化的前期標志之一，可隨著成骨細胞的生長而表達增加，可以代表骨形成的狀態。藥物作用48h后測MG-63細胞的ALP活性。如圖2a和2b所示，藥物濃度在3.12～50.00μmol/L時，與染料木素和維生素D₃單藥組相比，聯合組可顯著增強MG-63細胞中ALP活性。維生素D₃在濃度為3.12μmol/L和6.25μmol/L時抑制了ALP活性，而聯合染料木素可使維生素D₃對ALP活性的抑制作用逆轉。染料木素濃度在3.12，6.25，12.50μmol/L時可顯著增強ALP活性。

交聯的蛋白質和膠原蛋白隨著成骨細胞生長增殖，可產生羥基磷灰石并堆積在基質中礦化，茜素紅可結合形成的鈣結節發生顏色變化，產生深紅色的化合物。選擇濃度為6.25μmol/L的維生素D₃，染料木素及其二者聯合用藥組進行鈣結節的檢測。礦化培養21d后，可在倒置顯微鏡下觀察到MG-63細胞中的鈣結節，礦化組和試驗組形成了更多的不透明結節。如圖2c所示，積累的鈣結節被茜素紅染成深紅色化合物，形狀不規則，表明有成骨活性。加入10％的西吡氯銨（CPC）溶解結合鈣結節的茜素紅以定量鈣沉積情況，在550nm下測量吸光度值，如圖2d所示，表明維生素D₃聯合染料木素可形成更多茜素紅和鈣產生的深紅色化合物促進礦化基質的形成。

2.2 染料木素和維生素D₃對MG-63細胞OPG、RANKL表達的影響

藥物作用24h后，采用PT-PCR方法通過比較Ct法測定OPG和RANKL在成骨細胞的相對表達量。如圖3a和3b所示，與對照組相比，單藥染料木素組和維生素D₃組的OPGmRNA表達量均增加；而且與單藥組相比，染料木素聯合維生素D₃組OPGmRNA表達量顯著增加，但增加的作用不是呈劑量依賴性的。如圖3c和3d所示，與對照組相比，染料木素和維生素D₃組的MG-63細胞中RANKLmRNA表達均降低。在濃度為6.25～50.00μmol/L范圍內，聯合組的RANKLmRNA表達比維生素D₃組顯著降低，而與染料木素組對比無差異。OPG與RANKL的相對比例破壞可能導致骨吸收增加，微結構改變和骨折風險，在破骨細胞生物學和骨吸收調節中起到關鍵決定因素和最終步驟的作用，如圖3e和3f所示，聯合組中OPG/RANKL的比值顯著大于維生素D₃和染料木素組，且染料木素、維生素D₃以及維生素D₃與染料木素聯合組對OPG/RANKL的比值均隨著藥物濃度的增大而減小。表明維生素D₃與染料木素聯合可能通過OPG/RANKL途徑對成骨細胞增殖分化產生協同作用。此外，染料木素對MG-63細胞的增殖和分化作用較維生素D₃顯著。

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